Stratégie de l'échantillonnage
Stratégie du
prélèvement des échantillons de sol contaminés.
- à distance de 1m et profondeur de 5cm.
- à distance de 5m et profondeur de 10cm.
- prés de la
végétation qui pousse autour des bacs et à 5cm de profondeur.
La stratégie est conçue de cette manière dans
l'esprit de faire varier les échantillons
prélevés.
Isolement et purification des souches bactériennes
L'isolement:
Une öse de
chaque dilution préparée est ensemencée par étalement sur les deux milieux de
culture solides synthétiques M1 et M2. Le milieu M1 est un milieu qui sert à isoler
les bactéries productrices de biosurfactants. Il contient comme source de
carbone le glucose et le kérosène. Le glucose étant le substrat préférentiel
d'une large gamme de bactéries, donc sera la première source à utiliser
permettant ainsi l'obtention d'une biomasse bactérienne, mais une fois
consommé, il ne reste que le kérosène comme source de carbone pour les
bactéries capables de le dégrader.
Le milieu M2 est un milieu d'appoint utilisé en
parallèle avec le M1 pour permettre de mieux observer les souches puisqu'il est
d'un aspect et de couleur claire comparé à M1 et pour confirmer la capacité des
bactéries à utiliser le kérosène comme unique source de carbone.
L'ensemencement se fait par stries en surface
et les boites sont incubées pendant 18 - 24h à 30°C.
La
purification: Après le
premier ensemencement sur boite de Pétri, différentes colonies sont obtenues.
Chaque colonie d’aspect différent est ensemencée à part dans un milieu liquide.
Les tubes ensemencés seront incubés 18 à 24h à 30°C. La purification des souches
se fait par des passages successifs et alternés en milieu liquide, puis en
milieu solide jusqu’à l’obtention au sein d’une boite de Pétri de colonies
identiques par l’aspect et la couleur. Après plusieurs passages sur milieu
gélosé, la souche est en général purifiée et nous procédons au test
d’émulsification.
Sélection des souches productrices de biosurfactants
Test d'émulsification
Pour mettre en évidence la production
bactérienne de biosurfactants, nous effectuons un test qualificatif nommé test
d’émulsification, à partir des pré-cultures sur le milieu (M1) contenant 2% de
kérosène, voir les différentes étapes sur la figure 2.
Ce test consiste à colorer le kérosène avec un
colorant rouge lysochrome (soluble dans l'huile, Oil red O) à fin de distinguer
les deux phases: kérosène et bouillon ensemencé. Dans un tube à essai, on met
1.5ml de kérosène coloré et 3.5ml de moût de fermentation. La solution obtenue
est agitée au vortex pendant 3 minutes à la vitesse maximale, puis nous la
laissons reposer pendant une heure de temps. La qualité d'émulsion est estimée
à l'oeil nu par comparaison à un témoin ou le moût de fermentation est remplacé
par de l'eau distillée (J. E. Zajic et coll., 1977).
Index d’émulsion
À fin d’estimer l’activité d’émulsification,
nous pouvons calculer une valeur appelée index d’émulsion ou E24. Nous
ajoutons 3mL de kérosène coloré à 3mL de mout de fermentation. Le tout est
vortexé à la vitesse maximale pendant 2 minutes. Les mesures sont prises 24h
après (D. G. Cooper et coll., 1987). L’index d’émulsion représente la
hauteur de l’émulsion formé (He) devisée par la hauteur totale du
liquide dans le tube (Ht) multipliée par 100 :
E24 = (He /Ht) .100
L’index E24 permet une estimation quantitative
du taux d’émulsification par les différents isolats. Certaines bactéries émulsifient
totalement la quantité du kérosène ajoutée ; tandis que d’autres forment
des émulsions partielles.
Conservation des souches sélectionnées
Certain espèces Bactériennes capable a dégrader L’hydrocarbure
Pseudomonas pickettii
Bacillus megaterium
P. solanacearum
Enerobacter amnigenus biogroupe 1
P. putida
P. aeruginosa.
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